改良白膜法制备浓缩血小板及回收率的影响因素

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：白膜法和富含血浆法制备的浓缩血小板有无效输注发生率高和不良反应发生率高的缺点。
目的：观察改良白膜法制备浓缩血小板的实验研究，分析制备浓缩血小板回收率的影响因素。
方法：随机抽取126例站内采集后4-6 h的400 mL血液，随机分成改良白膜法组、白膜法组和富含血浆法组。改良白膜法采用3步离心，第1次采用次重离心，离心转速2 300 r/min，离心时间12 min，降速5，离心温度(22±2) ℃；第2次采用轻离心，离心转速910 r/min，离心时间10 min，离心温度(22±2) ℃；第3次离心转速2 800 r/min，离心时间12 min，离心温度(22±2)℃，离心后，挤去上层含血小板较少的血浆，袋中留30 mL血浆悬浮血小板，即为浓缩血小板。通过数据库文献检索的方法分析制备浓缩血小板回收率的影响因素。
结果与结论：改良白膜法、白膜法以及富含血浆法制备的手工浓缩血小板中，制备前各组血小板总数差别无统计学意义(P > 0.05)；富含血浆法组和改良白膜法组较白膜法组血小板回收率高，差异有显著性意义(P < 0.05)，但富含血浆法组和改良白膜法组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；白膜法组和改良白膜法组较富含血浆法组残留红细胞和残留白细胞的量少，差异有显著性意义(P < 0.05)，白膜法组与改良白膜法组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。制备浓缩血小板的回收率受到全血量、离心转速、离心时间、离心方法等因素的影响。改良白膜法制备浓缩血小板减少红细胞和白细胞的残留量，提高了血小板的回收率，可在血液中心或中心血站推广应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 改良白膜法, 浓缩血小板, 血小板, 血小板回收率, 手工浓缩血小板, 白细胞, 红细胞, 不良反应

Abstract:

BACKGROUND: Buffy-coat-derived platelet concentrates and plasma-rich platelet concentrates have a high incidence of invalid infusion and adverse reactions.
OBJECTIVE: To observe the improved preparation of buffy-coat-derived platelet concentrates and to analyze the influential factors relevant to platelet recovery.
METHODS: 400 mL of blood sample extracted from 126 cases were randomly divided into improved buffy-coat group, buffer-coat group and platelet-rich plasma after 4-6 hours. The 3-step centrifugal method was used for improved preparation of buffy-coat-derived platelet concentrates: step 1, centrifugation at 2 300 r/min for 12 minutes at (22±2)℃ with a deceleration of 5; step 2, centrifugation at 910 r/min for 10 minutes at (22±2)℃; step 3, centrifugation at 2 800 r/min for 12 minutes at (22±2)℃. After centrifugation, the upper layer containing few platelets was removed, and the rest 30 mL platelet suspension was platelet concentrates. Factors affecting platelet recovery were analyzed through literature retrieval.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no difference in platelet number among the three groups before preparation of platelet concentrates (P > 0.05). A higher rate of platelet recovery was found in the platelet-rich plasma group and improved buffy-coat group compared with the buffy-coat group (P < 0.05), but there was no difference between the former two groups (P > 0.05). There were less residual red blood cells and white blood cells in the two buffy-coat groups than the platelet-rich plasma group (P < 0.05), but there was no difference between the two buffy-coat groups (P > 0.05). The recovery rate of prepared platelet concentrates was affected by the whole blood amount, centrifugal speed, centrifugation time and methods. Improved buffy-coat method for preparation of platelet concentrates can be generalized in blood centers or blood stations, because it can reduce residual red blood cells and white blood cells and increase rate of platelet recovery.

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Key words: platelets, platelet count, blood transfusion, leukocytes, erythrocytes

中图分类号:

R318

单泓，王姣杰，别立莉，刘敏，戚正，段艳丽. 改良白膜法制备浓缩血小板及回收率的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 1082-1087.

Shan Hong, Wang Jiao-jie, Bie Li-li, Liu Min, Qi Zheng, Duan Yan-li. Improved preparation of buffy-coat-derived platelet concentrates and factors affecting platelet recovery[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(7): 1082-1087.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 材料

原料血：随机抽取126例站内采集后4-6 h的400 mL血液，100×10⁹ L^-1≤血小板计数≤300×10⁹ L^-1，全血采集时间不超过10 min，随机分成改良白膜法组、白膜法组和富含血浆法组。

仪器和设备：大容量离心机，泰尔茂ACD 400 mL四联血袋和泰尔茂三联采血袋。

1.2 方法

1.2.1 改良白膜法

第1次离心：400 mL于6 h内采集(22±2) ℃保存的四联袋全血，次重离心，离心转速2 300 r/min，离心时间12 min，降速5，离心温度(22±2) ℃。

富血小板血浆和白膜分离：离心后将白膜置于分浆夹上，目视挑选，凡红细胞混入过多，或白膜发生凝聚及太薄者予以淘汰。把白膜上层尽可能多的富血小板血浆全部导入母袋远端空袋，然后将约30 mL白膜计入母袋远端的另一空袋中，加入血浆使其达到110 mL，震荡混匀，导管中无血液残留，将红细胞保存液加入母袋，制备成悬浮红细胞，热合分离。

第2次离心：将富血小板血浆袋，白膜袋和空袋平整放入离心杯中(使白膜袋略高于富浆袋，以便白膜袋中血浆与红细胞更好分层)，加入适当填充物以避免袋体产生皱褶，轻离心。离心转速910 r/min，离心时间10 min，离心温度(22±2) ℃。

去红细胞：离心后将富血小板的血浆袋和白膜袋置于分浆夹上，将富血小板血浆和白膜袋中的血浆挤入空袋，若富血小板血浆袋有肉眼可见红细胞，则用血浆冲洗后导入原白膜袋，原白膜袋剩余红细胞约30 mL废弃，热合分离。目视挑选，凡红细胞混入过多者可按普通冰冻血浆制备。

第3次离心：富血小板血浆袋和空袋平整放入离心杯中，离心转速2 800 r/min，离心时间12 min，离心温度(22±2) ℃。离心后，挤去上层含血小板较少的血浆，袋中留30 mL血浆悬浮血小板，即为浓缩血小板。

血小板解聚：浓缩血小板分离后放置在血小板保存箱中，静置1 h，开机震荡血袋，使血小板完全解聚，于(22±2) ℃震荡保存。

1.2.2 白膜法 第1次离心，离心转速1 300 r/min，离心时间7 min，第2次离心，离心转速2 500 r/min，离心时间12 min，具体操作同改良白膜法。

1.2.3 富含血浆法 第1次离心转速2 000 r/min，离心时间7 min，降速7，将血浆尽可能多的挤入远端空袋中，将保养液加入母袋中，制成悬浮红细胞，热合分离。第2次离心转速2 800 r/min，离心时间12 min，将血浆挤入空袋中，血浆袋中留约70 mL富含血小板的血浆。目视，若红细胞混入过多，则废弃。

1.3 检测指标及方法 全血的血小板计数，浓缩血小板悬液中的血小板计数，残留红细胞，白细胞计数，血小板回收率(手工浓缩血小板中血小板总数/制备前血小板总数)×100%。

1.4 统计学分析 全血的血小板计数，浓缩血小板悬液中的血小板计数，残留红细胞，白细胞计数和血小板回收率均以x(_)±s表示，3种方法的两两比较采用t 检验。

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讨论

3.1 制备浓缩血小板回收率的影响因素分析

3.1.1 白膜层静置时间对手工制备浓缩血小板的影响 禹晓彬等^[2]曾研究白膜层静置时间对浓缩血小板回收率的影响，以提高白膜法制备的质量，重离心后分离出白膜层，将白膜层静置0，0.5，1.0，2.0 h后再轻离心制备浓缩血小板，计算各组浓缩血小板的回收率(表2)。
3.1.2 不同离心条件对手工制备浓缩血小板的影响 李小梅等^[3]分析手工制备浓缩血小板的影响因素，以确保血小板的质量和临床输注效果。随机选择献血者且献血前72 h内未服用过阿斯匹林类药物，外周血小板计数≥150×10⁹ L^-1，观察不同离心条件相同分离方法对收集血小板的影响结果(表3)。

3.1.3 不同规格全血和不同离心条件对手工制备浓缩血小板的影响 唐泽萍^[4]也详细的分析了不同规格全血在不同离心条件下对手工制备浓缩血小板的影响，将400，300，200 mL全血分别进行离心，第1次轻离心，离心温度22 ℃，200 mL全血离心转速2 000 r/min，离心时间5 min；300 mL全血离心转速2 000 r/min，离心时间6 min，400 mL全血离心转速2 100 r/min，离心时间6 min。轻离心后血小板会因比重较轻大部分保留在上层的血浆中，红细胞下沉。离心后轻取血袋放于分浆夹上分出上层部分血浆既富含血小板血浆于转移袋，热合分离红细胞袋后，将转移袋内富含血小板血浆混匀进行第2次重离心，离心温度22 ℃，离心转速3 000 r/min，离心时间5 min，离心后分出上层血浆，下层既为血小板浓缩液，血小板浓缩液在(22±2) ℃下静止平放1 h，解聚后轻摇，放入(22±2) ℃血小板震荡箱内保存。不同离心时间和离心转速条件下制备手工浓缩血小板的比较(表4)，不同规格全血条件下制备手工浓缩血小板的比较(表5)。

3.1.4 不同规格全血、不同离心条件以及不同离心方法条件对手工制备浓缩血小板的影响 张玉红等^[5]以随机选择200 mL和400 mL全血在不同离心条件下制备浓缩血小板的方法，将分离方法分为分浆夹式和悬挂式，分浆夹式分离法是将离心后的血液置于分浆夹内，固定后打开止血夹，依靠分浆夹的压力把富血小板血浆挤入空袋内，由于血液固定较好，分离界面不易破坏，并能较好控制流速，因而浓缩血小板收集率相对较高，红细胞及白细胞的混入量相对较少。检测不同规格全血、不同离心条件及不同分离方法对血小板回收数量的影响(表6，7)。

3.2 关于血小板及浓缩血小板采集的国内外情况分析 血小板在血液中的体积较小，是最晚被研究发现的细胞，血小板可以在血液中生存7-10 d，在凝血过程中起到重要的作用^[6]。献血者的健康检查要求中规定，单采血小板献血者血红蛋白，男≥120 g/L，女≥115 g/L；如采用硫酸铜法，男≥1.052 0，女≥1.051 0；红细胞比容≥0.36；采前血小板计数≥150×10⁹ L^-1，且<450×10⁹ L^-1；预测采后血小板数≥100×10⁹ L^-1。单采血小板献血者每次可献一两个治疗单位，或者1个治疗单位及不超过 200 mL血浆。全年血小板和血浆采集总量不超过10 L。单采血小板献血间隔不少于2周，不大于24次/年。因特殊配型需要，由医生批准，最短间隔时间不少于1周。单采血小板后与全血献血间隔不少于4周。全血献血后与单采血小板献血间隔不少于3个月^[7]。人体血液中，由于红细胞、粒细胞和血小板的密度分别为1.090-1.111 g/mL、1.080-1.095 g/mL和1.030-1.060 g/mL，利用血小板与其它血液成分的密度不同，可以采用离心方法将全血中血小板分离出来^[8]。由于机采血小板具有血小板含量高，不良反应发生率低等优势，在临床应用中占有重要的位置，但由于机采血小板的价格昂贵，而且来源较少，无法满足临床需要，由于手工血小板的需求量依然很大，尤其是欧美国家，手工采集的血小板一直占血小板用量的绝大多数^[9-10]，以欧盟12个国家浓缩血小板的应用情况举例^[11]。目前，中国常用的血小板制备方法是富含血浆法和白膜法。手工血小板价格低廉，来源于采集全血中的血小板，手工血小板的制备可以避免这一资源的浪费，且从全血中分离白膜后获得的血小板，可降低全血保存后微聚物的形成，降低了受血者发生栓塞的危险性，减少了非溶血性输血反应的发生^[12-13]，以欧盟国家和英国对手工浓缩血小板的质量要求举例^[11]。

手工制备浓缩血小板的回收率受许多因素的影响^[14-16]，如全血量、离心转速、离心时间、血液保存液，血袋表面光滑度、采血前后保存和运输过程等，如果血小板质量受到影响，会导致血小板输注的无效^[17-19]。分浆式分离方法由于两板紧夹血液，血液容易固定，红细胞界面清楚，控制流速理想，浓缩血小板收集率高，可以较好的控制红细胞及白细胞的混入。悬挂式分离由于血液垂直悬挂，血液固定性差，受外来阻力影响较大，红细胞界面欠清楚，控制流速不理想，血小板收集量少，红细胞及白细胞混入量较多。王姣杰等^[20]对手工制备的浓缩血小板进行细菌筛查，随机筛检 2 860袋手工浓缩血小板，细菌阳性率为0.07%，1例为金黄色葡萄球菌，1例为表皮葡萄球菌，因此，在手工浓缩血小板的制备过程中要特别重视细菌污染的问题。

由于富含血浆法制备的血小板离心强度较大，对血小板损伤大，导致血小板活性下降，而且红细胞的残留率和白细胞的残留率较高，导致浓缩血小板输注后的不良反应发生率增加。白膜法制备的浓缩血小板，其红细胞残留率和白细胞残留较富含血浆法少，但血小板回收率相对较低。为了克服传统手工血小板制备方法的缺陷，河南省红十字血液中心在白膜法的基础上进行了改良。改良后的白膜法第1次采用次重离心，使血小板尽可能多的留在血浆中，与重离心相比，白膜层更易析出，并使残留在白膜层中的血小板尽可能多的挤出来，经检测白膜层可收集到全血中(26.2±8.2)%的血小板，而富含血浆法无法收集该层中的血小板，因此，与富含血浆法相比，减少了残留在悬浮红细胞中的血小板数，提高了血小板的回收率。第2次采用轻离心，离心后使血浆和白膜层中的血小板集中在一起，然后采用较高转速离心，从而分离血浆和血小板，与白膜法比较，使残留在血浆中的血小板减少，血小板的提取率增高。富含血浆法和白膜法受方法限制，导致血小板合格率低，改良白膜法结合了富含血浆法和白膜法的优点，提高了血小板的提取率，单位血小板含量比富含血浆法和白膜法均高，单位血小板含量高可以节省资源，节约患者费用，同时该方法亦降低白细胞和红细胞的残留率，每一步均是可控的，若目视不合格，则制成普通冰冻血浆，降低了报废率。改良白膜法利用现有的条件，不需要特殊设备，采用3步离心，操作简便易学，适用于血液中心或中心血站制备手工血小板，若改良白膜法能在全国范围内推广应用，可使中国血小板的制备工作步入一个新的阶段。

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延伸阅读

血小板在凝血过程中起重要作用，随着骨髓移植、外周血干细胞移植、抗肿瘤治疗以及免疫抑制剂等临床治疗应用的增加，对血小板的需求量不断增大，而机采血小板存在成本高，献血员招募较困难等缺点，已很难满足临床需要，手工浓缩血小板从全血中提取，具有成本较低，来源丰富的优点，因此，手工浓缩血小板在临床应用中占了很大比例，但怎样才能制备出高质量的手工浓缩血小板一直是困扰国内外医学界的一道难题。
中国目前常用的两种手工浓缩血小板的制备方法是富含血小板血浆法和白膜法，但富含血小板血浆法制备的血小板含量低，红细胞混入量较高，不良反应发生率高，对患者健康威胁大，而白膜法虽然安全性好，多次输注后无效输注发生率较富含血浆法低，但与机采血小板相比，血小板质量依然不够理想。为了克服传统手工血小板制备方法的缺陷，河南省红十字血液中心在白膜法的基础上进行了改良。
改良后的白膜法第1次采用次重离心，使血小板尽可能多的留在血浆中，与重离心相比，白膜层更易析出，并使残留在白膜层中的血小板尽可能多的挤出来，经检测白膜层可收集到全血中(26.2±8.2)%的血小板，而富含血浆法无法收集该层中的血小板，因此，与富含血浆法相比，减少了残留在悬浮红细胞中的血小板数，提高了血小板的回收率。第2次采用轻离心，离心后使血浆和白膜层中的血小板集中在一起，然后采用较高转速离心，从而分离血浆和血小板，与白膜法比较，使残留在血浆中的血小板减少，血小板的提取率增高。富含血浆法和白膜法受方法限制，导致血小板合格率低，改良白膜法结合了富含血浆法和白膜法的优点，提高了血小板的提取率，单位血小板含量比富含血浆法和白膜法均高，单位血小板含量高可以节省资源，节约患者费用，同时该方法亦降低白细胞和红细胞的残留率，每一步均是可控的，若目视不合格，则制成普通冰冻血浆，降低了报废率。
改良白膜法利用现有的条件，不需要特殊设备，采用3步离心，操作简便易学，适用于血液中心或中心血站制备手工血小板，若改良白膜法能在全国范围内推广应用，可使中国血小板的制备工作步入一个新的阶段。

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